常見(jiàn)問(wèn)題

常見(jiàn)問(wèn)題

抗體常見(jiàn)問(wèn)題

檢測系統常見(jiàn)問(wèn)題

  • 為何非生物素法檢測系統不用血清封閉？
    血清封閉的作用是封閉掉組織中的帶電荷團，防止它們與抗體結合，產(chǎn)生非特異染色．這并不影響接下來(lái)一抗的結合，因為這種結合是特異的，親和力遠遠高于因電荷作用的結合，血清與非特異性位點(diǎn)結合，可以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準確性和降低背景。
  • 如何選擇合適的檢測系統？
    目前，推薦使用非生物素法檢測系統，因為可以避免內源性生物素的干擾。您購買(mǎi)一抗的種屬來(lái)源和組織是兩個(gè)考慮要素。如果組織是人標本，一抗來(lái)源是小鼠，那么可以選擇通用型或者以2結尾的檢測系統；一抗來(lái)源是兔，那么選擇通用型或者以1結尾的。但是組織并不局限于人的標本，當然必須是能夠排除交叉性反應的動(dòng)物組織。比如，一抗是小鼠來(lái)源，再用于小鼠組織，那么小鼠組織內源性IgG就會(huì )干擾實(shí)驗結果。

免疫組化常見(jiàn)問(wèn)題

  • 無(wú)染色
    A. 真陰性。
    解決的方法非常簡(jiǎn)單，就是設立“陽(yáng)性對照”。如果陽(yáng)性對照有了表達，說(shuō)明染色的全過(guò)程和所有試劑都沒(méi)有問(wèn)題。如果此時(shí)測試片仍為陰性，便是真實(shí)的陰性，說(shuō)明組織或細胞沒(méi)有相應的抗原表達。反之，如果陽(yáng)性對照沒(méi)有著(zhù)色，表明染色過(guò)程中某個(gè)或某些步驟出了問(wèn)題或試劑出了問(wèn)題。
    B. 假陰性。
    （1） 是否加了試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
    （2）試劑是否按正確的順序加入以及孵育了足夠的時(shí)間。
    （3） 檢測系統是否和一抗匹配，這一點(diǎn)是非常重要的。
    （4）二抗檢測系統與顯色試劑不匹配。
    （5）抗體的稀釋比例是否過(guò)大及稀釋抗體的溶液是否正確。
    （6）標本中抗原含量過(guò)低也會(huì )出現陰性結果?？墒褂糜蟹糯笮谋O測系統進(jìn)行檢測。
    （7）所檢標本或切片的組織抗原是否丟失，如標本未及時(shí)固定或切片在室溫放置時(shí)間過(guò)長(cháng)都會(huì )使抗原丟失。最好用已知陽(yáng)性的標本來(lái)同時(shí)做陽(yáng)性對照。
    （8）抗體是否過(guò)了有效期和抗體的保存條件是否正確。
    （9） 色原/底物溶液是否失效，最簡(jiǎn)單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體滴加在一張白紙上，然后將制備好的底物溶液滴在上面，如果發(fā)生預期的顏色變化，則可排除底物的因素。
    （10）水溶性色原顯色后使用了含醇的復染液或用乙醇脫水、二甲苯透明（如AEC、BCIP/NBT、AP-Red等顯色試劑）。解決的辦法是重新染色。
    （11）沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過(guò)氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。
  • 弱陽(yáng)性
    A. 標本的固定方式。不當的固定方式或固定時(shí)溫度過(guò)高，都會(huì )影響到所檢測的抗原的數量和質(zhì)量。
    B. 抗原的修復方式。煮沸修復和高壓修復是國際公認的較好的修復方式，但具體使用那種修復方式應根據預實(shí)驗結果或廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行選擇。
    C. 抗體的稀釋度是否過(guò)高或者孵育的溫度/時(shí)間是否正確。應參照使用范圍，對所使用的一抗進(jìn)行梯度測試，找出最佳的使用濃度。
    D. 切片上遺留了過(guò)多的沖洗液，當抗體加至切片上時(shí)，等于人為地對抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。
    E. 孵育時(shí)切片是否放置水平，否則會(huì )導致抗體流失。
  • 非特異性染色
    A. 是否有效地去除了內源性酶和生物素。應注意的是，并不是每一種組織均需要進(jìn)行此步驟，但對于內源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。
    B. 滅活堿性磷酸酶：當使用堿性磷酸酶顯色系統時(shí)應滅活內源性的堿性磷酸酶。
    C. 滅活內源性過(guò)氧化物酶：當使用DAB顯色系統時(shí)應滅活內源性過(guò)氧化物酶。
    D. 取材時(shí)避開(kāi)出血、壞死區亦極重要。因為出血和壞死區內源性酶含量高，極易產(chǎn)生非特異染色。
    E. 所選擇的抗體是否符合實(shí)驗要求。因抗體不純、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過(guò)采用高純度、高效價(jià)的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來(lái)解決。
    F. 一抗的使用濃度是否過(guò)高。有些抗體濃度過(guò)高會(huì )使肌組織或纖維組織產(chǎn)生非特異著(zhù)色。
    G. 清洗是否充分。清洗時(shí)既要清洗干凈又不能使切片脫片，這是洗滌的原則。溶液內加入Tween-20，即可提高洗滌效果又可增加組織的通透性，使抗體與組織的結合更強。
    H. DBA的使用是否正確。DAB的孵育時(shí)間、保存和配制方式都可以產(chǎn)生某些背景顏色。
    I. 標本染色過(guò)程中是否曾經(jīng)干涸，否則會(huì )造成邊緣部的非特異性染色。
    J. 巨噬細胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現胞漿著(zhù)色，這種著(zhù)色不易避免，但可以通過(guò)形態(tài)學(xué)辨認出巨噬細胞而引起重視。
  • 全片著(zhù)色
    A. 抗體濃度過(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是找到適合自己實(shí)驗室的理想工作濃度。
    B. 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)或溫度較高。解決辦法是，嚴格執行操作規程。
    C. DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(cháng)：DAB最好現用現配，如有沉渣應進(jìn)行過(guò)濾后再用。
    D. 組織變干。解決的辦法是操作要認真仔細，采用免疫組化筆在組織周?chē)?huà)圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
    E. 切片在緩沖液或修復液中浸泡時(shí)間太長(cháng)（大于24小時(shí)）。
    F. 一抗變質(zhì)或質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過(guò)期的抗體要么不顯色、要么背景著(zhù)色。最好設立陽(yáng)性對照和用使用過(guò)的抗體作比較。
  • 陰陽(yáng)臉”著(zhù)色 “陰陽(yáng)臉”著(zhù)色
    A. 組織脫蠟時(shí)脫蠟液未沒(méi)過(guò)組織，使部分組織脫蠟不足或未脫蠟。
    B. 抗原修復時(shí)修復液未沒(méi)過(guò)組織使組織干燥，干燥的組織則不顯色。
    C. 滴加的抗體（一抗或二抗）流到了組織的一側，這是切片不平的緣故。通常應該在加完試劑后，仔細檢查。
    D. 加抗體時(shí)未完全覆蓋組織：如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開(kāi)使之將組織全部覆蓋。
    E. 用免疫組化筆在組織周?chē)?huà)圈時(shí)，劃線(xiàn)太靠近或畫(huà)到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理，試劑不能達到靠近劃線(xiàn)附近的組織也會(huì )出現這部分組織不顯色。
    F. 加抗體時(shí)產(chǎn)生了氣泡，氣泡下面的組織不顯色。由于氣泡中含氣，試劑被推到周?chē)?，因此，氣泡中心的組織會(huì )產(chǎn)生圓形的不著(zhù)色。解決辦法是滴加試劑時(shí)手法要輕，有氣泡時(shí)用牙簽捅破。
  • 灶片狀著(zhù)色
    A. 裱片時(shí)水未排盡，或組織的局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡，顯色過(guò)深。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應去盡，漂片時(shí)一旦產(chǎn)生了氣泡可將鑷子伸到水里從組織下面輕輕將氣泡移走。撈片后要傾斜放置幾分鐘利于水流走，然后在放到烤片儀上進(jìn)行烤片。
    B. 壞死組織灶，組織壞死后細胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結合導致最終著(zhù)色。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應避免選擇壞死組織較多的組織。
    C. 制作膠片時(shí)，膠的濃度太高，膠在載玻片上不均勻，顯色時(shí)膠厚的地方容易非特異灶片狀著(zhù)色。解決辦法是按照標準的制備方法進(jìn)行。
  • 抗體易位表達
    A. 錯誤的抗原修復方式，是抗體表達易位的常見(jiàn)原因。
    B. 不適當的組織處理可以出現細胞核著(zhù)色，如組織在二甲苯里浸泡時(shí)間太長(cháng)（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時(shí)間太長(cháng)、組織變干等，解決辦法是嚴格按照操作標準進(jìn)行工作。

FISH常見(jiàn)問(wèn)題

  • 消化不足
    表現：
    細胞成塊，沒(méi)有清楚的邊界；
    信號弱，可見(jiàn)細胞間連接物。
    解決：
    檢查酶溶液的溫度并增加消化時(shí)間；
    檢查預處理液的溫度并增加預處理的時(shí)間。
  • 過(guò)消化
    表現：
    沒(méi)有清楚的細胞邊界，細胞形態(tài)被破壞；
    可能有弱的或缺失的信號；
    熒光背景高。
    解決：
    檢查酶溶液的溫度并減少消化時(shí)間；
    檢查預處理液的溫度并減少預處理的時(shí)間。
  • 過(guò)預處理
    表現：
    沒(méi)有清楚的細胞邊界，具不規則的細胞形態(tài)；
    可能有弱的或缺失的信號。
    解決：
    檢查酶溶液的溫度并減少消化時(shí)間；
    檢查預處理液的溫度并減少預處理的時(shí)間。
  • 雜交時(shí)間不當
    表現：
    形態(tài)正常、信號弱；
    解決：
    增加雜交時(shí)間；
    檢查探針量；
    檢查雜交后洗脫條件。
  • 背景高
    原因：
    雜交后洗脫不充分。
    解決：
    檢查洗脫液的溫度。
  • 信號強度變化
    原因：
    由于氣泡造成的探針不均勻分布。
    解決：
    重復實(shí)驗并確認雜交期間蓋玻片下無(wú)氣泡；
    在探針混合物的第一接觸面加蓋蓋玻片。
  • 組織掉片或組織形態(tài)分解
    原因：
    組織固定不足；
    使用不恰當的玻片；
    不正確的烤片；
    移除蓋玻片時(shí)組織被撕掉；
    過(guò)消化；
    過(guò)預處理。
    解決：
    校驗固定條件；
    使用正確的玻片；
    校驗烤片條件；
    泡更長(cháng)的時(shí)間使蓋玻片脫落。
  • 過(guò)變性
    表現：
    線(xiàn)狀信號。
    解決：
    檢查變性的時(shí)間和溫度。
  • 無(wú)/弱信號
    可能的原因 推薦的解決方案
    未添加探針（別笑，特別是探針和雜交緩沖液分開(kāi)的非預混情況） 探針充分解凍，確保移液器吸取到探針試劑。
    探針、雜交緩沖液使用前沒(méi)有充分混勻（非預混探針） 吹打探針混合液，使探針充分混勻，短暫離心。
    探針添加數量不足 確保移液器吸取準確，探針加入量足量，請不要稀釋探針（包括預混和非預混）。 使用前確保探針解凍充分并達到室溫。
    變性前標本未制備好 請參照說(shuō)明書(shū)中標本制備相關(guān)說(shuō)明。
    標本及探針變性不充分 確保玻片進(jìn)行變性時(shí)溫度在推薦的溫度。 將玻片變性時(shí)間延長(cháng)2~4分鐘。
    變性前標本未制備好 請參照說(shuō)明書(shū)中標本制備相關(guān)說(shuō)明。
    標本及探針變性不充分 確保玻片進(jìn)行變性時(shí)溫度在推薦的溫度。 將玻片變性時(shí)間延長(cháng)2~4分鐘。
    雜交條件不合適 確保遵守雜交所規定的時(shí)間和溫度。 橡皮膠封片時(shí)勿留縫隙。 根據情況，調整雜交時(shí)間（跨度一般較大）和濕度。
    雜交時(shí)蓋玻片下有氣泡形成 放蓋玻片時(shí)要覆蓋探針表面，輕輕擠壓以便擠出氣泡。
    玻片干燥不充分 探針滴加至玻片前，確保玻片上的乙醇溶液已經(jīng)完全揮發(fā)。
    探針干燥太快 探針滴加后應立即將蓋玻片覆蓋目標區域。 進(jìn)行洗脫時(shí)，一次只能移除一張玻片上的蓋玻片，并且在移除下一張之前立即將玻片浸入洗脫液中。
    洗脫液或洗脫條件不正確 確保按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求配制洗脫液（生產(chǎn)商提供洗脫液的除外）。 確保洗脫液的溫度達到洗脫步驟所規定溫度。 玻片浸入洗脫液前移去蓋玻片。
    探針或標本玻片儲存不正確 確保探針-20℃避光保存。 將未雜交玻片干燥后置于-20℃長(cháng)期保存或者室溫短期保存（一般不超過(guò)兩星期）。 將雜交后玻片置于-20℃避光保存。
    觀(guān)察時(shí)所選用的濾光片不合適 使用正確濾光片觀(guān)察探針熒光情況。詳情咨詢(xún)探針供應商。
    顯微鏡構造及物鏡不適宜觀(guān)察FISH標本，或者濾片組損傷 請聯(lián)系顯微鏡制造商。
    汞燈使用時(shí)間超過(guò)設計時(shí)間 請更換汞燈。