


FISH
一、FISH探針是個(gè)啥?
熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization),簡(jiǎn)稱(chēng)FISH。 是采用熒光標記的DNA探針,利用探針與被檢測樣本DNA堿基對的互補性,在探針與樣本的DNA雜交后,通過(guò)熒光顯微鏡檢測熒光信號而得出結果,從而檢測細胞,組織樣本中的染色體或基因異常。
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首先,我們知道需要檢測的對象是DNA,而檢測目標DNA所用的工具是用熒光染料做了標記的DNA,能夠被觀(guān)察到,這個(gè)就是FISH探針了。
熒光信號最終需要被肉眼觀(guān)察到,而肉眼的分辨率是有限的,所以FISH探針的大小一般都比較長(cháng)一點(diǎn),多數有幾百個(gè)kb。由于本身這個(gè)特點(diǎn),FISH探針適用于檢測染色體的斷裂融合或者大片段的擴增、缺失或者染色體數目的變化,而不適用于突變檢測。
以最常見(jiàn)的HER2產(chǎn)品為例,設計原理如下:
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HER2基因位于17q11.2-q12,設計者把HER2探針標記為紅色,使其能夠覆蓋HER2基因,同時(shí),由于著(zhù)絲粒相對保守,把相應位點(diǎn)標記為綠色作為對照。
設計者選擇位點(diǎn)的差異以及工藝技術(shù)的差異則造成了不同探針敏感性和特異性的差異。
二、工欲善其事,必先利其器
目前市場(chǎng)上在售的FISH探針,顏色各不相同,那是因為標記的熒光素各不相同,主要的有以下幾種:
熒光素 | 顏色 | 激發(fā)波長(cháng) | 發(fā)射波長(cháng) |
FITC | 綠色 | 492 | 520 |
Cy3 | 橙色 | 550 | 570 |
TRITC | 橙紅色 | 550 | 620 |
Texas Red | 紅色 | 596 | 620 |
SpectrumOrange | 橙色 | 559 | 588 |
SpectrumGreen | 綠色 | 497 | 524 |
SpectrumAqua | 青藍色 | 433 | 480 |
DAPI | 藍色 | 367 | 452 |
熒光想被看到,需要被特殊光源激發(fā)后通過(guò)合適的濾光片才行,所以,探針生產(chǎn)商會(huì )在說(shuō)明書(shū)上標明自己生產(chǎn)探針所使用的熒光素種類(lèi),然后建議“顧客使用探針前向濾片組供應商了解所使用的濾片組的詳細情況,以便選擇與標記熒光染料相適應的濾片組”。選擇合適的濾光片是非常重要的,畢竟我們通過(guò)觀(guān)察FITC的濾光片怎么也看不見(jiàn)Cy3不是?
以常見(jiàn)的奧林巴斯BX53顯微鏡為例(其他品牌也差不多),它的濾光單元長(cháng)這樣:
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上圖中手里拿著(zhù)的小結構就是已經(jīng)裝了盒的濾光片。用來(lái)觀(guān)察FISH實(shí)驗結果的熒光顯微鏡,通常至少安裝有3組濾光片,分別用來(lái)觀(guān)察橙色、綠色以及藍色的熒光。濾光片可以單獨安裝,所以,實(shí)驗室如果已安裝了熒光顯微鏡,那么在開(kāi)展了新項目包含了新的熒光素種類(lèi)時(shí),拓展一個(gè)相應的濾色片就可以。
熒光顯微鏡中,除了濾色片,激發(fā)光源也需要注意,目前大多數熒光顯微鏡使用的是汞燈作為光源,而汞燈是有使用壽命的。所以,用了一段時(shí)間后,激發(fā)出的光變的弱了,老師,您的顯微鏡不是壞了,只是汞燈老了,換個(gè)嫩的就行。
FISH實(shí)驗中,主要的儀器除了熒光顯微鏡,還有原位雜交儀:
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原位雜交儀承擔了探針和樣本變性以及雜交的重任,可以提供精確且均一的溫度。
原位雜交儀不僅可以用來(lái)進(jìn)行熒光原位雜交的實(shí)驗,也可以做原理類(lèi)似的其他標記物(例如地高辛)標記的原位雜交實(shí)驗。
三、標準化是有必要的
FISH操作的步驟好像每一家都不是很一樣,它們之間的差異體現在哪兒?
其實(shí),不論具體的步驟,FISH實(shí)驗過(guò)程都可以被分成幾個(gè)大的部分:
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根據樣本類(lèi)型的不同,前期處理的方法也不同。目的在于保持組織細胞形態(tài)的完整,讓細胞或者組織以最好的狀態(tài)呈現在載玻片上。以最常見(jiàn)的石蠟樣本為例,推薦的處理方法如下(這個(gè)大家區別不大):
常溫下在10%中性福爾馬林緩沖液中固定24小時(shí),為了達到最佳和均勻的固定和石蠟包埋,樣本大小不宜超過(guò)0.5cm3。標準操作和石蠟包埋,使用高質(zhì)量的石蠟。滲透和包埋應在低于65℃下進(jìn)行。切成4μm厚度的切片。切片撈于防脫玻片并在50~60℃環(huán)境中固定2~16小時(shí)。
預處理包括脫蠟、預處理、酶消化,目的在于把細胞核裸露出來(lái)、增加膜的通透性,讓探針可以更好的進(jìn)入細胞核與染色體DNA結合。由于各家探針生產(chǎn)商生產(chǎn)的探針敏感性和特異性有差異,對樣本處理完的狀態(tài)要求也不盡相同(比如:探針敏感性足夠好,預處理的不是很好,探針也可以穿過(guò)核膜與染色體結合),所以預處理的條件會(huì )有一定的差異,各生產(chǎn)商所建議的預處理條件都是經(jīng)過(guò)多次試驗證明與其探針相適應的,因此建議實(shí)驗過(guò)程中按照生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
同理,探針的變性和雜交的過(guò)程就是探針與目標DNA的結合過(guò)程,想要結合的好,就需要理想的化學(xué)和溫度條件,而這個(gè)條件也是經(jīng)過(guò)梯度實(shí)驗最終確定的。
而雜交后洗脫的條件與變性雜交的條件有一定的關(guān)系,洗脫的溫度與時(shí)間都與探針最終的結合情況相關(guān),通俗來(lái)講,如果結合的好,那么洗的厲害點(diǎn)也沒(méi)關(guān)系,如果結合的不好,就得悠著(zhù)點(diǎn)洗了。DAPI是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料,因為DAPI可以透過(guò)完整的細胞膜,所以在FISH實(shí)驗中用于細胞核的復染。
綜上,由于各家探針敏感性和特異性的不同導致的所有操作條件上的差異,都是系統性的,因此在實(shí)驗過(guò)程中,并不建議不同生產(chǎn)商的探針和輔助試劑混用,按照說(shuō)明書(shū)上的標準操作進(jìn)行,有助于得到理想的實(shí)驗結果。當然,如果您的實(shí)驗室已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗確定了自己的標準操作條件,就大膽的上吧。