Pembrolizumab（Keytruda，MK-3475，Merck）是針對PD-1受體的抑制劑，于2014年9月被FDA批準用于治療轉移性黑色素瘤以來(lái)，腫瘤醫生獲得了一個(gè)治療癌癥的新工具。美國前總統卡特在經(jīng)過(guò)PD-1抑制劑治療后，治愈了晚期黑色素瘤。這讓PD-1抑制劑一躍成為很多人眼中的“抗癌神藥”。目前很多研究已經(jīng)證實(shí)MSI-H/dMMR患者能夠從免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療中獲益。因此需要在治療前對患者進(jìn)行微衛星不穩定性檢測，以評估患者是否能從PD-1治療中獲益。

（一）MMR-IHC方法（Immunohistochemistry, IHC）

常用免疫組織化學(xué)的方法，檢測腫瘤組織中錯配修復基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達蛋白。任何一項蛋白的缺失，即為dMMR，間接說(shuō)明微衛星不穩定（MSI），否則即為pMMR，間接說(shuō)明微衛星穩定（MSS）。此方法檢測MSI相對較簡(jiǎn)單，成本較低，大部分病理科均可進(jìn)行檢查。

定位準確，染色清晰，背景干凈

從全世界發(fā)病水平看，中國女性乳腺癌的發(fā)病和死亡水平較低。但由于中國人口基數大，中國仍是乳腺癌國，發(fā)病和死亡絕對數量均位列全球首位。

中杉金橋錯配四項

中杉金橋 PK 常規

（二）分子水平的檢測

1.MSI-PCR技術(shù)（polymerase chain reaction, PCR)

目前主要采用多重熒光PCR結合毛細管電泳的方法，來(lái)比較腫瘤組織與正常組織的位點(diǎn)突變情況。其用于比較的位點(diǎn)為美國國家癌癥研究所（NCI）推薦的5個(gè)微衛星位點(diǎn)：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250。其中≥2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變判定為高度微衛星不穩定（MSI-H），僅1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變判定為低度微衛星不穩定（MSI-L），無(wú)位點(diǎn)改變判定為微衛星穩定（MSS）。

但是關(guān)于最適合MSI檢測的位點(diǎn)仍存在爭議。大量的實(shí)驗證實(shí)，MMR免疫組化檢測結果與MSI的PCR檢測結果有高度關(guān)聯(lián)性，靈敏度92%，特異性可達100%，但花費較高，且在結果判斷中會(huì )碰到以下問(wèn)題：如熒光的過(guò)強或過(guò)少、非特異性峰、不顯著(zhù)的峰大小改變，雜合性缺失等。

2.MSI-NGS方法（Next Generation Sequencing, NGS）

NGS做為新一代測序方法，又稱(chēng)為第二代測序技術(shù)，是一種高通量測序技術(shù)，能一次性對幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條基因分子進(jìn)行序列測定。目前NGS方法已經(jīng)成為檢測MSI的新工具，其最大優(yōu)勢是可以實(shí)現多位點(diǎn)高通量檢測。

美國病理學(xué)家學(xué)會(huì )與分子病理學(xué)和抗擊結直腸癌協(xié)會(huì )組織專(zhuān)家共召開(kāi)了8次會(huì )議，審查了103篇相關(guān)文獻，對文章提供的數據進(jìn)行提取和定性分析，制定了該指南——《Mismatch Repair and Microsatellite Instability Testing for Immune Checkpoint Inhibitor Therapy》

該指南在評估現有的檢測方法時(shí)，考慮了錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的IHC，以及基于PCR的MSI檢測和通過(guò)NGS檢測DNA錯配修復缺陷的MSI，并總結出6項建議和3項聲明。

第一：針對結直腸癌（CRC）患者，指南強烈建議病理學(xué)家使用MMR-IHC或MSI-PCR的方法確定微衛星不穩定性。雖然NGS檢測可用于確定CRC患者M(jìn)SI以評估檢查點(diǎn)抑制劑使用資格，但免疫組化和PCR是首選方法。專(zhuān)家小組成員認為：“NGS檢測必須通過(guò)MMR-IHC或MSI-PCR一致性驗證，并且必須顯示兩者具有等效性?！?/P>

第二：對于胃食管癌或小腸癌患者，應使用MMR-IHC或MSI-PCR，而不是NGS。

第三：對于子宮內膜癌患者，強烈推薦使用MMR-IHC而不是MSI-PCR或基于NGS的MSI檢測。

第四：除CRC、胃食管腺癌、小腸癌和子宮內膜癌以外的其他癌癥類(lèi)型，腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家應注意“必須針對特定的癌癥類(lèi)型進(jìn)行充分驗證，仔細評估MMR-IHC、MSI-NGS、MSI-PCR檢測DNA錯配修復缺陷的性能特點(diǎn)?！?/P>

Broaddus坦言：“第四項建議更多地是對巨大知識差距的關(guān)注，而不是具體的建議。廣泛的NGS檢測可能對試圖通過(guò)一次評估獲取盡可能多腫瘤分子信息的腫瘤學(xué)家有吸引力，但這種便利不應超過(guò)這樣一個(gè)事實(shí)，即對于許多癌癥類(lèi)型，尚沒(méi)有足夠的證據表明NGS可準確地確定dMMR或MSI狀態(tài)。臨床醫務(wù)工作者需要意識到，如果對患者進(jìn)行NGS，可能會(huì )錯過(guò)其他癌癥類(lèi)型的高水平MSI，尤其是胃腸道癌癥之外的其他癌癥。

第五：不應將腫瘤突變負荷（TMB）視為檢測dMMR狀態(tài)的替代指標。如果腫瘤被確定為T(mén)MB-H，病理學(xué)家可以通過(guò)MMR-IHC或MSI-PCR的檢測，來(lái)確定TMB-H是否繼發(fā)于dMMR。雖然對于CRC，TMB-H與dMMR有很多重疊，但對于其他癌癥類(lèi)型，兩者重疊很小。

對于第五條建議，Broaddus及其同事強調：“ TMB-H雖然在某些情況下可能是dMMR或MSI-H狀態(tài)的標志，但并不能視為與其他兩個(gè)生物標志物相同?！?/P>

第六：如果對患者進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)抑制劑資格分析后發(fā)現與Lynch綜合征一致的dMMR，強烈建議病理學(xué)家將此發(fā)現傳達給患者的主治醫生，因為這種遺傳性綜合征意味著(zhù)會(huì )增加其他癌癥風(fēng)險?！?/P>

三個(gè)良好實(shí)踐聲明集中在腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家如何處理不一致的檢測結果。這一點(diǎn)對于IHC尤其重要，因為專(zhuān)家在許多指南中首先推薦IHC檢測方法。不過(guò)在特定情況下，該方法可以根據病理學(xué)家的個(gè)人解釋產(chǎn)生不同的結果。新指南中包含的良好實(shí)踐聲明在處理差異方面提供了一些指導。

Broaddus表示：“IHC的好處在于更普遍，很多基礎的臨床實(shí)驗室能夠進(jìn)行這一操作，但缺點(diǎn)是具有一定的主觀(guān)性，而且需要具備一定的專(zhuān)業(yè)知識。從長(cháng)遠來(lái)看，病理學(xué)家的培訓計劃應該包括解釋IHC的檢測結果?！?/P>

第一：如果檢測結果不一致，病理學(xué)家應采用IHC、NGS、PCR檢測MSI其中的任何陽(yáng)性結果，從而允許患者接受免疫治療。但對不一致的結果應進(jìn)行嚴格審查，確定這種不一致的現象不是由錯誤的解釋所導致的。

第二：如果任何方法的結果不確定，病理學(xué)家應執行替代技術(shù)或在不同的腫瘤塊上重復相同的技術(shù)。對不確定檢測結果的情況，實(shí)驗室應該建立一個(gè)全面的同行評審程序。

第三：在MMR-IHC亞克隆缺失的情況下，病理學(xué)家應通過(guò)PCR進(jìn)行MSI驗證，特別是在IHC丟失MMR蛋白的腫瘤解剖區域。

該指南對MMR-IHC的強調，特別是對結直腸癌、胃食管、胃食管連接處、小腸以外的腫瘤類(lèi)型。Large-panel NGS無(wú)疑為癌癥患者提供了更多的基因組信息，有時(shí)甚至可以識別Lynch綜合征患者。有證據表明，MSI-NGS對于正在考慮接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的CRC、胃食管、胃食管結合部、小腸癌患者是一種很好的檢測方法。

然而，這些相同的MSI-NGS方法對于其他類(lèi)型的癌癥通常不是好的檢測方法的，因為沒(méi)有足夠已發(fā)表的證據支持。為了準確檢測這些其他癌癥類(lèi)型中的MSI-H，可能需要開(kāi)發(fā)出每種腫瘤類(lèi)型特有的替代NGS算法。

驗證MSI-NGS方法的相關(guān)幾項研究中存在另一個(gè)缺點(diǎn)：MMR-IHC或MSI-PCR接近100%的一致性，這通常不能解釋由于低標本腫瘤細胞純度（在一項研究中接近25%的病例）或由于不確定的結果（在一項研究中為15%）而排除的病例。顯然，對于許多活組織檢查或細針穿刺來(lái)說(shuō)，NGS的低腫瘤細胞分數的限制是一個(gè)重要的問(wèn)題，惡性腫瘤的診斷可能僅基于少數腫瘤細胞的存在。有發(fā)表的關(guān)于MSI-NGS效用的大型研究，其包括數千名患有許多不同癌癥類(lèi)型的患者，該研究數據表明：通常MSI僅在結直腸癌或子宮內膜癌患者中通過(guò)MMR-IHC或MSI-PCR驗證，因為dMMR在這些癌癥類(lèi)型中更為常見(jiàn)，而許多其他類(lèi)型的癌癥缺乏關(guān)鍵的交叉分析驗證。