PD-L1免疫組化檢測的現狀及存在的問(wèn)題

北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司研發(fā)部 戚聞?wù)g

眾所周知，腫瘤的發(fā)生率逐年提高已經(jīng)成為一個(gè)不爭的事實(shí)，隨之而來(lái)的是人類(lèi)抗腫瘤治療方法的不斷更新。腫瘤的治療在經(jīng)歷了手術(shù)、放療、化療和靶向治療后，已經(jīng)逐漸進(jìn)入了免疫治療的階段。免疫治療是通過(guò)激發(fā)和增強機體抗腫瘤的免疫應答來(lái)協(xié)同機體免疫系統殺傷腫瘤、抑制腫瘤生長(cháng)，是一種利用患者自身免疫系統對抗腫瘤的治療方式。腫瘤的免疫治療分為被動(dòng)免疫治療和主動(dòng)免疫治療兩類(lèi)。I-O（Immuno-Oncology） 治療是主動(dòng)免疫治療的主要手段之一，目前國際上I-O治療的主要研究方向是免疫檢查點(diǎn)抑制劑，有代表性的包括PD-1/PD-L1抑制劑和CTLA-4拮抗劑。

免疫檢查點(diǎn)是一類(lèi)免疫抑制性的分子，可以調節免疫反應的強弱和范圍，從而避免正常組織的損傷和破壞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，免疫檢查點(diǎn)成為免疫耐受的主要原因之一。免疫檢查點(diǎn)療法就是通過(guò)共抑制或共刺激信號等一系列途徑調節T細胞活性來(lái)提高抗腫瘤免疫反應的治療方法。

PD-1是T細胞表面的重要抑制分子，其胞內段含有一個(gè)ITIM和一個(gè)免疫受體酪氨酸轉換基序（ITSM），ITSM介導了蛋白酪氨酸磷酸酶家族磷酸酶的募集以及對T細胞活化信號的抑制，其配體為PD-L1和PD-L2，主要在免疫系統效應期的腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。PD-L1在多種腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境的造血細胞中有誘導性的表達，通過(guò)與PD-1的結合，誘導產(chǎn)生機體的免疫抑制，從而使腫瘤細胞獲得免疫逃逸，這也許是腫瘤耐受的機制之一。如果將其結合阻斷，就有可能阻斷這種免疫抑制，使機體自身的T細胞活化，從而達到免疫治療的目的。由于多種腫瘤均有可能通過(guò)上述機制進(jìn)行免疫抑制，所以免疫檢查點(diǎn)抑制劑就有可能成為抗腫瘤的“萬(wàn)能藥”。理論上講，如果能夠證實(shí)腫瘤中存在PD-1/PD-L1的高表達，那么免疫檢查點(diǎn)抑制劑就有可能有效，所以目前世界各大藥廠(chǎng)均把目光聚集在這類(lèi)藥物的研發(fā)上，并且已經(jīng)先后有三種藥物經(jīng)過(guò)美國FDA批準上市，預計明年也會(huì )通過(guò)CFDA認證在中國上市。國內的多家藥企同類(lèi)藥物也有多項正在進(jìn)行Ⅲ期臨床測試，市場(chǎng)前景廣闊。

目前FDA已批準上市的免疫檢查點(diǎn)抑制劑有百時(shí)美施貴寶的nivolumab和默沙東的pembrolizumab，兩者均為PD-1抑制劑。nivolumab是全人源化IgG4單抗，其主要適應癥是惡性黑色素瘤及BRAF V600野生型不可切除性或轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌、轉移性腎細胞癌、霍奇金淋巴瘤和頭頸部鱗癌等；pembrolizumab是人源化IgG4單抗，主要適應癥是晚期或不可切除的惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌等二線(xiàn)治療，更于今年10月獲NCCN推薦用于非小細胞肺癌一線(xiàn)治療并獲FDA批準。

FDA批準的PD-L1抑制劑是羅氏制藥的ateolizumab，是迄今批準的唯一一個(gè)PD-L1抑制劑，為全人源化的IgG1單抗，與PD-L1高親和力結合后阻斷了PD-L1與PD-1的相互作用，達到抑制PD-1/PD-L1通路的作用，臨床試驗的適應癥主要為非小細胞肺癌和移行性膀胱癌。

到目前為止，三種藥物的使用適應癥大多需要進(jìn)行PD-L1免疫組化檢測，絕大多數腫瘤均在高表達的腫瘤中獲得良好的效果，所以FDA在批準三種藥物上市的同時(shí)，也分別批準了相應的伴隨診斷試劑。

FDA批準的OPDIVO?（nivolumab）伴隨診斷免疫組化試劑為PD-L1 IHC 28-8 pharmDx，應用兔單抗28-8和EnVision FLEX可視系統，在A(yíng)utostainer Link 48染色平臺上檢測非小細胞肺癌（鱗癌除外）和黑色素瘤石蠟切片中PD-L1的表達狀況，從而指導臨床用藥。PD-L1蛋白表達的定義是腫瘤細胞所呈現的任何強度的細胞膜陽(yáng)性的百分率，細胞質(zhì)染色（如果存在）不參與評分。在非小細胞肺癌（鱗癌除外）中，應用該伴隨診斷試劑所檢測出的PD-L1表達與使用OPDIVO所獲得的延長(cháng)生存期相關(guān)，如果PD-L1表達陰性，即<1%的非小細胞肺癌（鱗癌除外）腫瘤細胞呈現出任何強度的完整的或不完整的線(xiàn)性化細胞膜染色，此條件下服用OPDIVO的效果與服用多烯紫杉醇（對照）的效果等同；若>=1% PD-L1表達，服用OPDIVO有41%的可能性（病人）延長(cháng)8.1月生存期；若>=5% PD-L1表達，服用OPDIVO有57%的可能性（病人）延長(cháng)10.1月生存期；若>=10% PD-L1表達，服用OPDIVO有60%的可能性（病人）延長(cháng)11.4月生存期。在黑色素瘤中，該伴隨診斷試劑所檢測的PD-L1表達與使用藥物的無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)。非小細胞肺中鱗癌用藥與PD-L1表達無(wú)關(guān)。

FDA批準的KEYTRUDA?（pembrolizumab）伴隨診斷免疫組化試劑為PD-L1 IHC 22C3 pharmDx，應用小鼠單抗22C3和EnVision FLEX可視系統，在A(yíng)utostainer Link 48染色平臺上檢測非小細胞肺癌石蠟切片中PD-L1的表達狀況，從而指導臨床用藥。PD-L1蛋白應用TPS（Tumor Proportion Score）來(lái)定義，即呈現部分或完整細胞膜染色的可視腫瘤細胞的百分率。如果TPS≥ 50%，即為PD-L1陽(yáng)性，也就意味著(zhù)適合用藥；反之，如果TPS在1~49%，即為PD-L1陰性，不適合用藥。

FDA批準的TECENTRIQ?（ateolizumab）伴隨診斷免疫組化檢測試劑為VENTANA PD-L1 (SP142) Assay，應用兔單抗SP142和OptiView DAB IHC檢測試劑盒，在VENTANA BenchMark ULTRA染色平臺對尿路上皮癌的石蠟切片進(jìn)行PD-L1表達的分析。PD-L1表達狀況定義為任何強度PD-L1+的浸潤免疫細胞（IC）所占據的腫瘤細胞面積的百分比，腫瘤細胞上的PD-L1表達不參與評分。在尿路上皮癌中≥ 5% IC與使用藥物所帶來(lái)的客觀(guān)緩解率增加密切相關(guān)。近期，該伴隨診斷試劑又擴大至于非小細胞肺癌，其評判標準也進(jìn)行了改進(jìn)，除了繼續沿用針對IC表達進(jìn)行評判之外，也加入了對于TC的評判，是唯一一個(gè)對腫瘤細胞和浸潤的淋巴細胞均加以考慮的檢測試劑，評估基于PD-L1任何強度表達的腫瘤浸潤性免疫細胞占腫瘤面積的比例（%IC）或PD-L1任何強度表達在腫瘤細胞中的比例（% TC）。 VENTANA PD-L1 (SP142)檢測測定的NSCLC組織中≥50% TC或≥10% IC有PD-L1表達可能與TECENTRIQ（atezolizumab）提高總生存率相關(guān)。

不難看出，目前針對PD-L1的檢測狀況是“One drug，One assay”，這種“一種藥物一種檢測”的模式，包括不同的診斷標準，已嚴重地影響到伴隨診斷在病理日常診斷工作中的應用。FDA在陸續批準上述伴隨診斷試劑的同時(shí)，也意識到了這種問(wèn)題的存在，所以由FDA牽頭，四家PD-1/PD-L1 抑制劑研發(fā)企業(yè)（AstraZeneca、BMS、Roche、Merck）、二家診斷試劑公司（Dako/Agilent 、Ventana/Roche）和二家學(xué)術(shù)機構（IASLC：the International Association for the Study of Lung Cancer及AACR：American Association for Cancer Research）參與，進(jìn)行了名為藍印倡議（Blueprint Initiative）的研究，通過(guò)對四種方法（包括目前尚未被批準的SP263兔單抗）進(jìn)行對比，找到其可能的一致性，用于指導臨床合理使用PD-1/PD-L1抑制劑。但不對抗體的好和壞進(jìn)行評判；不評估檢測的特異性和敏感性；不判定臨床和治療的關(guān)系。

從階段Ⅰ的數據來(lái)看，四種檢測方法中，28-8、22C3和SP263在腫瘤染色方面一致性較好，唯有SP142是個(gè)例外；在四種方法中，免疫細胞上PD-L1的表達較之腫瘤細胞上的表達差異性更大（參見(jiàn)圖1和2）；依然有36.9%的病例表現出不一致的結果。免疫組化依然作為檢測PD-L1蛋白表達的金標準，鼓勵使用陽(yáng)性/陰性來(lái)定義PD-L1的表達，但可能會(huì )朝向定義更加多元化的判定來(lái)替代單一的Cutoff值。

階段Ⅰ的結果對現階段的臨床影響有限，原因是入組的試驗樣本數量過(guò)少，樣本類(lèi)型單一。隨著(zhù)人們對不同免疫檢查點(diǎn)藥物反應性不同背后所隱藏的生物學(xué)意義的更加深入的了解，更新的檢測方法和使用復雜的生物標記物來(lái)捕捉腫瘤微環(huán)境的變化，以及這些變化與藥物的相關(guān)性；探索新的標記物與治療的相關(guān)性，包括突變負荷、新抗原、基因圖譜、PD-L1基因組擴增、CTCs中PD-L1的表達、細胞游離的DNA、感染性腫瘤、復合免疫分析、腫瘤內異質(zhì)性、基線(xiàn)血清細胞因子、LDH、基因表達特性等等，都會(huì )變得更加有意義。